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UV1901PC紫外可見分光光度計(jì)測(cè)二羥基丙酮含量

二羥基丙酮(1,3-dihydroxyaceton，簡稱DHA，1)是一種天然存在的酮糖，具有生物可降解性，對(duì)人體和環(huán)境無毒害，可食用。1是一種重要的醫(yī)藥中間體，也可作為一種抗病毒試劑 [1]。1能與皮膚zui上層物質(zhì)（如角質(zhì)層內(nèi)的氨基酸）發(fā)生Maillard反應(yīng)使皮膚達(dá)到棕色到深色的染色效果。根據(jù)這一原理1在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療白癲風(fēng)[2]，它也被用來做為混合型卟啉病的保護(hù)劑[3]。還有研究表明在紫外照射下1能延緩皮膚癌變[4]。

1的生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法，國外比較成熟的工業(yè)生產(chǎn)主要是用含有甘油脫氫酶的微生物以甘油底物發(fā)酵生產(chǎn)。目前，發(fā)酵液中1檢測(cè)方法有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、薄層層析法[7]。氣相色譜法測(cè)定時(shí)1不能直接汽化，需要進(jìn)行衍生化，操作繁瑣；液相也比較耗時(shí)。薄層層析法只能定性分析，無法定量。在酸性溶液中1的酮基與二苯胺（diphenylamine，2）的氨基發(fā)生反應(yīng)生成藍(lán)色復(fù)合物，在608 nm處吸光度與1的濃度呈線性關(guān)系，在酸性條件下，2不與甘油發(fā)生反應(yīng)。

圖1 2分光光度法反應(yīng)原理

1  儀器與試劑

UV1901PC型紫外可見光分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）

1（Bio Basic公司）；2（上海試劑三廠）；無水乙酸；濃硫酸；甘油；酵母粉；磷酸二氫鉀。

菌種：葡糖桿菌Gluconobacter sp. HD 410，由河南大學(xué)生物工程研究所篩選并保藏。發(fā)酵培養(yǎng)基成分：甘油10%，酵母粉1.5%，無水KH2PO4­ 0.5%，pH自然。

2  方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

1溶液：準(zhǔn)確稱取1 1 g，于1000 ml容量瓶中定容，制成1 g/l 母液，分別加蒸餾水配制成0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 g/l的1梯度溶液。

2溶液：準(zhǔn)確稱取2 0.6 g，量取無水乙酸54 ml邊攪拌邊加入濃硫酸 6 ml，混勻后加入稱取的2，至*溶解后密封保存。

2.2  2分光光度法測(cè)定1

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0.5 ml 1梯度溶液，4.5 ml 2溶液，于比色管中沸水浴14 min，流水冷卻。以不含1的溶液為空白參比，UV1901PC紫外可見分光光度計(jì)608 nm處測(cè)樣品的吸光值。每個(gè)樣品三次重復(fù)，取平均值。

2.3發(fā)酵液1含量測(cè)定：取對(duì)數(shù)期種子液，按5%的接種量接入搖瓶。200 r/min，28°C發(fā)酵3~4 d，取發(fā)酵液1.5 ml，8000 g離心10 min。取上清液0.5 ml用蒸餾水稀釋100倍，取0.5 ml稀釋液加入4.5 ml 2溶液，沸水浴14 min，流水冷卻。以未接種發(fā)酵液為空白，在608 nm處測(cè)吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中1含量。

2.4 甘油濃度測(cè)定

用高碘酸氧化法[8]測(cè)發(fā)酵液中甘油的含量。

2.5 測(cè)定條件研究

2.5.1 測(cè)定波長的選擇

按2.2方法以蒸餾水為空白參比掃描不同1濃度400～700 nm的吸收光譜。每個(gè)樣品三次重復(fù)。

是保持同樣的的2溶液濃度，僅改變1濃度得到的一系列吸收光譜。從圖2中可以看出，在608 nm波長處顯色反應(yīng)有zui大吸收值，且吸光度的增加與1溶液濃度的增加成正比。盡管在405 nm波長處顯色反應(yīng)也有吸收峰，但峰值較低，因而本法zui終選擇測(cè)定波長為608 nm (OD608)。

圖2不同1濃度吸收光譜

2.5.2 顯色劑用量的選擇

取0.2 g/l 1溶液0.5 ml，分別加入含不同濃度的2溶液，顯色反應(yīng)后流水冷卻，測(cè)定吸光度OD608。由圖3A得出結(jié)論，2含量高于1%（w/v）時(shí)吸光值不再增加，用量過少導(dǎo)致1與其不能充分反應(yīng)，所測(cè)結(jié)果比實(shí)際偏低，故本法zui終選擇的顯色劑用量為1%（w/v）

 A不同濃度2對(duì)吸光值的影響；  B不同濃度濃硫酸含量對(duì)吸光值的影響；

C不同溫度對(duì)吸光度的影響；    D反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光值的影響

2.5.3 硫酸用量的確定

在酸性條件下1才能與2結(jié)合，生成藍(lán)色的復(fù)合物。由圖3B得出結(jié)論，濃硫酸含量為10%時(shí)生成的藍(lán)色復(fù)合物吸光值達(dá)到zui大。濃硫酸加入量不足或過多均導(dǎo)致吸光值偏低，且硫酸加入量過多會(huì)使反應(yīng)冷卻后吸光值不穩(wěn)定。

2.5.4 加熱溫度的選擇

常溫下2與1反應(yīng)很慢，3C表明，在沸水浴條件下，生成的復(fù)合物吸光值z(mì)ui大，用冷水冷卻后吸光值穩(wěn)定。

2.5.5 加熱時(shí)間的選擇

沸水浴條件下反應(yīng)需一定的時(shí)間1才能與2充分反應(yīng)，3D表明，沸水浴14 min后，吸光值z(mì)ui大，且吸光值穩(wěn)定，有利于準(zhǔn)確測(cè)定；隨著加熱時(shí)間的增加，吸光值略有降低，冷卻后吸光值不穩(wěn)定。因而，本法選用的沸水浴時(shí)間為14 min。

2.6  測(cè)定方法的影響因素

2.6.1   顯色穩(wěn)定時(shí)間的選擇

取不同濃度1溶液與顯色劑反應(yīng)后，在不同時(shí)間測(cè)定吸光值，試樣溶液在顯色完成至12 h內(nèi)吸光值穩(wěn)定，表明本方法顯色穩(wěn)定性良好。

2.6.2 相關(guān)影響因素研究

取發(fā)酵72 h的發(fā)酵液與未接種的培養(yǎng)基，8000 g離心10 min。取0.5 ml未接種培養(yǎng)基，以水為空白對(duì)照測(cè)吸光值，培養(yǎng)基在OD608值為0。結(jié)果說明甘油和培養(yǎng)基中的雜質(zhì)對(duì)該測(cè)定方法沒有影響。

量取1 ml離心上清液，加入4 ml無水乙醇[9]，搖勻，離心后吸上清加蒸餾水稀釋100倍，測(cè)其吸光值。與未加乙醇沉淀蛋白質(zhì)的發(fā)酵液相比，二者吸光值沒有顯著的差別。結(jié)果表明菌體自溶產(chǎn)生的可溶性蛋白對(duì)該檢測(cè)方法影響不大。

2.7  線性范圍及檢測(cè)限

按“2.2”項(xiàng)下方法分別配制不同濃度的1溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，結(jié)果表明1的濃度在0.5 g/l以內(nèi)時(shí)，吸光度（A）與質(zhì)量濃度（c）呈線性關(guān)系。1濃度為0.1～0.4 g/l時(shí)，0.2≤ OD608 ≤0.8，回歸方程為A=0.00855+1.9095c (r2=0.999)，線性良好。

2.8 精密度、回收率及準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

取發(fā)酵液待測(cè)樣品，按照10 g/l和15 g/l的量精密加入1，按“2.2”項(xiàng)下方法反應(yīng)后測(cè)定1的含量（重復(fù)測(cè)定五次），結(jié)果見表1所示，本方法的平均回收率和RSD均在正常誤差范圍之內(nèi)。

表1   精密度和回收率測(cè)定（n=5）

此外，對(duì)樣品還進(jìn)行了分光光度法和HPLC法測(cè)定的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以測(cè)定該法的準(zhǔn)確度。將含有不同濃度1（10~100 g/l）的發(fā)酵液稀釋后分別按照“2.2”和“2.3”項(xiàng)中方法分別進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法的測(cè)量誤差在2%以內(nèi)，進(jìn)一步證明本測(cè)定方法不受發(fā)酵液中甘油雜質(zhì)的影響，具有相對(duì)較高的準(zhǔn)確度。

2.9  發(fā)酵液中1濃度變化曲線的測(cè)定

按照“2.2”項(xiàng)中的方法，測(cè)定發(fā)酵液中1濃度變化曲線，并同時(shí)測(cè)定甘油的濃度變化（方法見“2.4”項(xiàng)），結(jié)果如圖4。從圖中可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，底物甘油呈下降趨勢(shì)，在微生物分泌的酶作用下被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物1，108 h時(shí)1產(chǎn)量達(dá)到64.5 g/l，轉(zhuǎn)化率達(dá)到79.6%（1/甘油，w/w）。

  甘油轉(zhuǎn)化生成1曲線

3. 討論

本文建立了用2分光光度法測(cè)定甘油為底物的發(fā)酵液中1含量的方法。測(cè)定*波長選為608 nm，2*濃度為1%（w/v）；沸水浴加熱時(shí)間14 min。該方法測(cè)定過程不受發(fā)酵液中甘油和可溶性蛋白影響，具有顯色穩(wěn)定、測(cè)量快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，非常適合于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1工藝中的產(chǎn)物測(cè)定。

結(jié)論：甘油為底物發(fā)酵液中二羥基丙酮的分光光度檢測(cè)方法。考察顯色劑的用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、顯色穩(wěn)定時(shí)間、發(fā)酵液成分和發(fā)酵液中菌體自溶物等對(duì)測(cè)定的影響。該方法的相關(guān)系數(shù)R2=0.999，檢測(cè)范圍0.1～0.4 g/l，樣品回收率達(dá)102.4%，測(cè)定結(jié)果不受發(fā)酵液中甘油及其它雜質(zhì)影響，具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。